Chris Redfield wird im Auftrag der Bio-Terrorism Security Assessment Alliance (BSAA) in das fiktive afrikanische Dorf Kijuju geschickt, um dort den Waffenhändler Ricardo Irving zu fassen. Irving handelt mit Bio-Organischen Waffen (BOWs) und den aus den Vorgängerspielen bekannten Viren zur biologischen Kriegsführung. In Kijuju trifft Redfield auf die afrikanische BSAA-Agentin Sheva Alomar. Ihre Eltern kamen bei einem Zwischenfall in einem Labor der Umbrella Cooperation ums Leben, was Sheva letztlich dazu bewegte, sich der BSAA anzuschließen.

In Zwischensequenzen wird ein weiterer Handlungsstrang erzählt, der seinen Ursprung vor der Geschichte von Resident Evil 5 nahm: So konnten Chris Redfield und seine Partnerin Jill Valentine den aus den Vorgängerspielen bekannten Erzschurken Albert Wesker auf dem Anwesen von Ozwell E. Spencer stellen. Es kam zu einem Kampf, in dem Wesker aufgrund der ihm injizierten Viren körperlich überlegen war. Jill stürzte mit Wesker aus dem Fenster des Anwesens in eine Schlucht, woraufhin beide für tot gehalten wurden. Chris Redfield sieht jedoch auf einem PDA das Bild einer Frau, die er als Jill zu erkennen glaubt. Er möchte daraufhin neben seinem Auftrag klären, ob Jill noch am Leben ist.

Im Verlauf des Spiels können Chris und Sheva den durch die Uroboros-Viren mutierten Irving besiegen und treffen dann auf Wesker und Jill, die von Wesker durch ein Kontrollgerät psychisch kontrolliert wird. Sie befreien Jill und besiegen im letzten Level des Spieles schließlich auch Wesker während eines Kampfes in einem Vulkan.

Resident Evil 5 greift viele offene Fragen aus den Vorgängerspielen auf und erklärt zahlreiche Zusammenhänge. So wird etwa Weskers Werdegang beleuchtet, die Entstehung der Umbrella Cooperation dargestellt und die Evolution der Viren skizziert.